非酒精性脂肪性肝病模型大鼠饮食或二甲双胍干预后肝视黄醇结合蛋白4表达

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.49.024

中国组织工程研究 ›› 2014, Vol. 18 ›› Issue (49): 8007-8014.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2014.49.024

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非酒精性脂肪性肝病模型大鼠饮食或二甲双胍干预后肝视黄醇结合蛋白4表达

马红¹，郭春花¹，杨香玖¹，鲁华东²，陈立刚³，黄延玲¹，张文强¹

厦门大学附属中山医院(福建医科大学厦门中山教学医院)，¹内分泌科，²病理科，³消化内科，福建省厦门市 361004

修回日期:2014-09-09 出版日期:2014-11-30 发布日期:2014-11-30
作者简介:马红，女，1972年生，山东省淄博市人，汉族，2000年北京大学毕业，博士，主任医师，副教授，主要从事糖尿病、肥胖等内分泌代谢性疾病的研究。
基金资助:
福建省医学创新课题项目资助(2011-CXB-37)

Effects of dietary intervention versus metformin treatment on retinol binding protein 4 expressions in rats with non-alcoholic fatty liver disease

Ma Hong¹, Guo Chun-hua¹, Yang Xiang-jiu¹, Lu Hua-dong², Chen Li-gang³, Huang Yan-ling¹, Zhang Wen-qiang¹

¹Department of Endocrinology, Zhongshan Hospital, Xiamen University (Xiamen Zhongshan Teaching Hospital of Fujian Medical University), Xiamen 361004, Fujian Province, China; ²Department of Pathology, Zhongshan Hospital, Xiamen University (Xiamen Zhongshan Teaching Hospital of Fujian Medical University), Xiamen 361004, Fujian Province, China; ³Department of Gastroenterology, Zhongshan Hospital, Xiamen University (Xiamen Zhongshan Teaching Hospital of Fujian Medical University), Xiamen 361004, Fujian Province, China

Revised:2014-09-09 Online:2014-11-30 Published:2014-11-30
About author:Ma Hong, M.D., Ph. D., Chief physician, Associate professor, Department of Endocrinology, Zhongshan Hospital, Xiamen University (Xiamen Zhongshan Teaching Hospital of Fujian Medical University), Xiamen 361004, Fujian Province, China
Supported by:
a grant from Fujian Provincial Medical Innovation Program, No. 2011-CXB-37

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前关于血清视黄醇结合蛋白4在非酒精性脂肪性肝病中的表达水平仍存在争议。

目的：研究饮食或二甲双胍干预对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝脏视黄醇结合蛋白4表达的影响。

方法：将50只SD大鼠随机分为6组，8周对照组，正常饮食8周后处死；8周高脂组，高脂饮食8周制作非酒精性脂肪性肝病模型，随后处死；16周对照组，正常饮食16周后处死；16周高脂组，高脂饮食16周后处死；饮食干预组，8周高脂饮食后再正常饮食8周，随后处死；二甲双胍治疗组，8周高脂饮食后，继续8周高脂饮食，同时给予二甲双胍灌胃治疗，随后处死。采用ELISA法检测血清视黄醇结合蛋白4水平及生化指标，免疫组织化学法、Western blotting法、RT-PCR法检测肝脏组织视黄醇结合蛋白4表达。

结果与结论：高脂饮食成功建立非酒精性脂肪性肝病大鼠模型，随造模时间延长，大鼠肝脏由单纯性脂肪肝逐渐进展成为脂肪性肝炎。饮食干预可改善高脂饮食引发的肝组织视黄醇结合蛋白4表达下降、肝功能异常、脂代谢紊乱和胰岛素抵抗，二甲双胍治疗仅改善了高脂饮食引发的肝脂肪变。结果表明肝组织视黄醇结合蛋白4表达的改变可能在非酒精性脂肪性肝病发病中起一定作用，饮食干预应作为防治非酒精性脂肪性肝病的基本措施，二甲双胍可以改善非酒精性脂肪性肝病的肝脂肪变。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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关键词: 实验动物, 组织工程, 非酒精性脂肪性肝病, 视黄醇结合蛋白4, 饮食干预, 二甲双胍, 肝组织病理

Abstract:

BACKGROUND: Conflicting data have been reported regarding the expression of retinol-binding protein 4 in non-alcoholic fatty liver disease.

OBJECTIVE: To evaluate the impact of dietary intervention versus metformin treatment on expression of retinol-binding protein 4 in rats with non-alcoholic fatty liver disease.

METHODS: Fifty male Sprague-Dawley rats were randomized to six groups, including two normal control groups (rats were killed after 8 and 16 weeks of normal diet), two HFD groups (rats were killed after 8 and 16 weeks of high-fat diet), one dietary intervention group (rats were killed after 8 weeks of high-fat diet and 8 weeks of normal diet) and one metformin treatment group (rats were killed after 8 weeks of high-fat diet and 8 weeks of high-fat diet and metformin treatment). The levels of retinol-binding protein 4 in serum and biochemical indexes were detected through enzyme-linked immunosorbent assay. The expression of retinol-binding protein 4 mRNA in liver tissues was measured via western blot analysis, immunohistochemistry and RT-PCR.

RESULTS AND CONCLUSION: Non-alcoholic fatty liver disease models were successfully established by high-fat diet. Liver tissues of high-fat diet fed rats showed progressing non-alcoholic fatty liver disease histology, from non-alcoholic fatty liver to non-alcoholic steatohepatitis. Dietary intervention increased retinol-binding protein 4 expression in liver tissue as well as improving liver enzyme, dyslipidemia and insulin resistance, and alleviated impaired liver histology. Metformin treatment only alleviated hepatic steatosis caused by high-fat diet. The results indicated that retinol-binding protein 4 expression might play a role in the pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease. Metformin treatment can alleviate non-alcoholic fatty liver disease histology,dietary intervention should be the fundamental treatment.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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Key words: rat, fatty liver, retinol-binding proteins

中图分类号:

R318

马红，郭春花，杨香玖，鲁华东，陈立刚，黄延玲，张文强. 非酒精性脂肪性肝病模型大鼠饮食或二甲双胍干预后肝视黄醇结合蛋白4表达[J]. 中国组织工程研究, 2014, 18(49): 8007-8014.

Ma Hong, Guo Chun-hua, Yang Xiang-jiu, Lu Hua-dong, Chen Li-gang, Huang Yan-ling, Zhang Wen-qiang. Effects of dietary intervention versus metformin treatment on retinol binding protein 4 expressions in rats with non-alcoholic fatty liver disease [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2014, 18(49): 8007-8014.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 实验纳入大鼠50只，喂养过程顺利，全部进入结果分析。

2.2 大鼠体质量、肝湿质量及肝指数的变化 与正常对照组相比，高脂饮食组大鼠体质量明显增加，并随着高脂喂养时间的延长呈逐渐上升的趋势。虽然8周高脂组较8周对照组动物体质量增长无统计学意义(P=0.067)，但8周高脂组大鼠的肝湿质量和肝指数都较8周对照组明显增加(P < 0.001)。与16周对照组大鼠相比，16周高脂组的大鼠体质量(P < 0.01)，肝湿质量和肝指数均明显增加(P < 0.001)。同时，与8周高脂组的大鼠相比，16周高脂组大鼠体质量(P < 0.001)，肝湿质量(P < 0.01)和肝指数(P < 0.05)也均显著增加。与16周高脂组相比，饮食干预组和二甲双胍治疗组大鼠体质量均呈下降的趋势，分别下降约6%和4.6%，虽然均没有统计学意义(P > 0.05)，但饮食干预和二甲双胍治疗后大鼠的肝湿质量和肝指数均出现显著下降(P < 0.05)，见表1。

2.3 血清RBP4及其他生化指标的变化 与正常对照组相比，高脂饮食组大鼠血清RBP4水平有升高的趋势，但未达统计学意义。8周高脂组大鼠空腹血糖水平较8周对照组有所增高，16周高脂组大鼠空腹血糖与16周对照组大鼠相比无明显变化，但胰岛素水平及胰岛素抵抗指数均较相应对照组大鼠明显增高。分别予饮食干预和二甲双胍治疗后，虽然空腹血糖、血浆胰岛素和胰岛素抵抗变化均未达统计学意义，但胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均呈现出下降趋势，且饮食干预组大鼠下降趋势更明显。

8周高脂组大鼠血清谷丙转氨酶水平明显高于8周对照组；16周高脂组大鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平均明显高于16周对照组大鼠；饮食干预组大鼠谷丙转氨酶和谷草转氨酶水平与16周高脂组大鼠相比均显著降低，二甲双胍治疗组大鼠谷丙转氨酶水平与16周高脂组大鼠相比显著增高(P < 0.05)。与正常对照组相比，高脂饮食组大鼠脂质代谢参数如总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇均升高，高密度脂蛋白胆固醇降低。与16周高脂组大鼠相比，饮食干预能改善以上所有指标，但二甲双胍治疗对以上脂质代谢参数并无明显影响(表2)。

2.4 肝组织病理变化 正常对照组肝组织细胞形态、小叶结构及汇管区均未见异常，肝细胞脂肪变性几不可见。高脂饮食组全肝小叶脂质沉积明显，8周高脂组大部分为小脂滴，伴有气球样变，肝窦间隙变窄；16周高脂组肝细胞均出现中、重度大泡性脂肪变，多数肝细胞排列紊乱，肿胀、气球样变，可见成群炎性细胞浸润，肝窦间隙明显变窄。与16周高脂组相比，饮食干预组肝细胞脂肪变性明显好转，脂肪变细胞减少，肝窦间隙无明显变窄，无炎性细胞浸润，无明显坏死；二甲双胍治疗组肝细胞脂肪变性好转，脂肪变细胞未见明显减少，但各细胞脂滴变小，气球样变减少，无明显坏死，肝窦间隙仍变窄。各组肝组织均未见明显肝纤维化(图1)。8周高脂组NAFLD勾当度积分4.67±0.52比8周对照组评分0.67±0.82明显增高(P < 0.001)；16周高脂组NAFLD勾当度积分6.83±1.33较16周对照组评分1.0±0.89明显升高(P < 0.001)。与16周高脂组相比，饮食干预组NAFLD勾当度积分3.00±1.26及二甲双胍治疗组评分5.33±0.52均明显降低。

2.5 肝脏RBP4免疫组织化学结果 图2免疫组织化学结果显示，抗RBP4棕褐色免疫颗粒在肝细胞中特异性广泛表达，其他细胞类型包括胆管细胞、肝星状细胞、内皮细胞和炎症细胞中无表达，阳性染色位于肝细胞胞质。高脂饮食组较正常对照组肝脏RBP4蛋白表达下降，8周高脂组较8周对照组降低(t=3.674，P < 0.01)，16周高脂组较16周对照组降低(z=-3.338，P=0.001)，16周高脂组较8周高脂组略降低，但无统计学差异；与16周高脂组相比，饮食干预组RBP4表达升高(t=2.319，P < 0.05)，二甲双胍治疗组RBP4蛋白表达无太大变化(t=0.767，P > 0.05)，见图3。

2.6 肝组织RBP4的免疫组化评分与肝组织学变化的相关性分析 运用Spearman相关分析法分析肝组织RBP4的免疫组化评分与肝组织学病理变化的相关性，得出结果：肝组织RBP4的免疫组织化学评分与肝脏的炎症分级呈显

著负相关(r=-0.354，P=0.029)，与脂肪百分比(r=-0.281，P=0.092)、气球样变(r=0.034，P=0.843)无明显相关性。

2.7 肝脏RBP4 Western blotting检测结果 该法所测肝脏RBP4蛋白表达结果与免疫组织化学法所测结果一致，正常对照组肝脏RBP4蛋白表达量高，高脂饮食组表达下降，8周高脂组较8周对照组降低(t=3.301，P < 0.01)，16周高脂组较16周对照组降低(t=5.573，P < 0.001)，16周高脂组较8周高脂组略降低，但无统计学差异；与16周高脂组相比，饮食干预组明显恢复肝组织RBP4蛋白的表达(t=4.769，P < 0.01)，二甲双胍治疗无法恢复RBP4蛋白的表达(t=-0.382，P > 0.05)，见图4。

2.8 肝脏RBP4 mRNA检测结果 用RT-PCR法检测大鼠肝脏RBP4 mRNA的表达，发现肝脏RBP4 mRNA在正常对照组中表达量高，在高脂组表达量降低，8周高脂组较8周对照组降低(t=4.405，P < 0.01)，16周高脂组较16周对照组降低(z=-2.309，P < 0.05)，16周高脂组较8周高脂组进一步降低(t=6.278，P < 0.01))；与16周高脂组相比，饮食干预组明显恢复肝组织RBP4 mRNA的表达(z=-2.309，P < 0.05)，二甲双胍治疗未恢复RBP4 mRNA的表达(t=0.767，P > 0.05)，见图5。

参考文献

[1] Angulo P.GI epidemiology: nonalcoholic fatty liver disease. Aliment Pharmacol Ther.2007;25(8):883-889.

[2] Williams R.Global challenges in liver disease.Hepatology. 2006; 44(3):521-526.

[3] Fan JG,Zhu J,Li XJ,et al.Prevalence of and risk factors for fatty liver in a general population of Shanghai,China.J Hepatol. 2005;43(3):508-514.

[4] Fan JG,Farrell GC.Epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease in China. J Hepatol.2009;50(1):204-210.

[5] 中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组.非酒精性脂肪性肝病诊疗指南[J].中华肝脏病杂志,2010,18(3):163-166.

[6] Rabe K,Lehrke M,Parhofer KG,et al.Adipokines and insulin resistance.Mol Med. 2008;14(11-12):741-751.

[7] Yang Q,Graham TE,Mody N,et al.Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes.Nature.2005;436(7049): 356-362.

[8] Stefan N,Hennige AM,Staiger H,et al.High circulating retinol binding protein 4 is associated with elevated liver fat but not with total, subcutaneous,visceral, or intramyocellular fat in humans.Diabetes Care.2007;30:1173-1178.

[9] Terra X,Auguet T,Broch M,et al.Retinol Binding Protein-4 Circulating Levels Were Higher in Nonalcoholic Fatty Liver Disease Vs.Histologically Normal Liver From Morbidly Obese Women.Obesity,2012.

[10] Tan Y,Sun LQ,Kamal MA,et al.Suppression of retinol-binding protein 4 with RNA oligonucleotide prevents high-fat diet- induced metabolic syndrome and non-alcoholic fatty liver disease in mice. Biochim Biophys Acta.2011; 1811(12): 1045-1053.

[11] Cengiz C,Ardicoglu Y,Bulut S,et al.Serum retinol-binding protein 4 in patients with nonalcoholic fatty liver disease: does it have a significant impact on pathogenesis? Eur J Gastroenterol Hepatol.2010;22(7):813-819.

[12] Schina M,Koskinas J,Tiniakos D,et al.Circulating and liver tissue levels of retinol-binding protein-4 in non-alcoholic fatty liver disease.Hepatol Res.2009;39(10):972-978.

[13] ]Nobili V,Alkhouri N,Alisi A,et al.Retinol-binding protein 4: a promising circulating marker of liver damage in pediatric nonalcoholic fatty liver disease. Clin Gastroenterol Hepatol. 2009;7(5):575-579.

[14] Alkhouri N,Lopez R,Berk M,et al.Serum retinol-binding protein 4 levels in patients with nonalcoholic fatty liver disease.J Clin Gastroenterol.2009;43(10): 985-989.

[15] Schattenberg JM,Schuppan D.Nonalcoholic steatohepatitis: the therapeutic challenge of a global epidemic.Curr Opin Lipidol.2011;22(6):479-488.

[16] Mazza A,Fruci B,Garinis GA,et al.The role of metformin in the management of NAFLD. Exp Diabetes Res.2012;2012: 716404.

[17] Sofer E,Boaz M,Matas Z,et al.Treatment with insulin sensitizer metformin improves arterial properties, metabolic parameters, and liver function in patients with nonalcoholic fatty liver disease: a randomized, placebo-controlled trial. Metabolism.2011;60(9):1278-1284.

[18] Anstee QM,Goldin RD.Mouse models in non-alcoholic fatty liver disease and steatohepatitis research.Int J Exp Path. 2006;87:1-16.

[19] Kajikawa S,Harada T,Kawashima A,et al.Suppression of hepatic fat accumulation by highly purified eicosapentaenoic acid prevents the progression of d-galactosamine-induced hepatitis in mice fed with a high-fat/high-sucrose diet. Biochim Biophys Acta.2009;1791(4):281-288.

[20] Safwat GM,Pisanò S,D'amore E,et al.Induction of non-alcoholic fatty liver disease and insulin resistance by feeding a high-fat diet in rats: does coenzyme Q monomethyl ether have a modulatory effect? Nutrition.2009;25(11-12): 1157-1168.

[21] Ratziu V,Poynard T.Assessing the outcome of nonalcoholic steatohepatitis? It's time to get serious.Hepatology.2006; 44(4):802-805.

[22] Kleiner DE,Brunt EM,Van Natta M,et al.Design and validation of a histological scoring system for nonalcoholic fatty liver disease.Hepatology.2005;41(6): 1313-1321.

[23] Blomhoff R,Blomhoff HK.Overview of retinoid metabolism and function. J Neurobiol, 2006;66(7):606-630.

[24] Hanley AJ,Williams K,Festa A,et al.Liver markers and development of the metabolic syndrome. DIabetes. 2005; 54: 3140-3147.

[25] Tonjes A,Bluher M,Stumvoll M.Retinol-binding protein 4 and new adipocytokines in nonalcoholic fatty liver disease.Current Pharmaccutical Design.2010;16:1921-1928.

[26] Quadro L,Hamberger L,Colantuoni V,et al.Understanding the physiological role of retinol-binding protein in vitamin A metabolism using transgenic and knockout mouse models. Mol Aspects Med.2003;24(6):421-430.

[27] Smeland S,Bjerknes T,Malaba L,et al.Tissue distribution of the receptor for plasma retinol -binding protein. Biochem J.1995;305:419-424.

[28] Romanowska A,Lebensztejn DM,Skiba E,et al.Retinol binding protein-4 as a serum biomarker of intrahepatic lipid content in obese children--preliminary report.Acta Biochim Pol. 2011; 58(1):35-38.

[29] Milner KL,Van Der Poorten D,Xu A,et al.Adipocyte fatty acid binding protein levels relate to inflammation and fibrosis in nonalcoholic fatty liver disease. Hepatology.2009; 49(6): 1926-1934.

[30] Brandauer J,Landers-Ramos RQ,Jenkins NT,et al.Effects of prior acute exercise on circulating cytokine concentration responses to a high-fat meal.Physiological Reports.2013; 1(3):e00040.

[31] Lewis JG,Shand BI,Elder PA,et al.Plasma retinol-binding protein is unlikely to be a useful marker of insulin resistance. Diabetes Res Clin Pract.2008;80(1): e13-15.

[32] He L,Sabet A,Djedjos S,et al.Metformin and insulin suppress hepatic gluconeogenesis through phosphorylation of CREB binding protein.Cell.2009;137(4): 635-646.

[33] Musso G,Cassader M,Rosina F,et al.Impact of current treatments on liver disease, glucose metabolism and cardiovascular risk in non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): a systematic review and meta-analysis of randomised trials.Diabetologia. 2012;55(4):885-904.

[34] Loomba R,Lutchman G,Kleiner DE,et al.Clinical trial: pilot study of metformin for the treatment of non-alcoholic steatohepatitis. Aliment Pharmacol Ther.2009;29(2):172-182.

[35] Francque SM,Verrijken A,Mertens I,et al.Noninvasive assessment of nonalcoholic fatty liver disease in obese or overweight patients. Clin Gastroenterol Hepatol.2012; 10(10):1162-1168.

[36] Garinis GA,Fruci B,Mazza A,et al.Metformin versus dietary treatment in nonalcoholic hepatic steatosis: a randomized study.Int J Obes (Lond).2010;34(8):1255-1264.

[37] Nar A,Gedik O.The effect of metformin on leptin in obese patients with type 2 diabetes mellitus and nonalcoholic fatty liver disease.Acta Diabetol.2009;46(2):113-118.

[38] Abenavoli L.Metformin: a therapeutic option for treating nonalcoholic fatty liver disease.Dig Dis Sci.2010;55(7):2121.

[39] Raso GM,Esposito E,Iacono A,et al.Comparative therapeutic effects of metformin and vitamin E in a model of non-alcoholic steatohepatitis in the young rat.Eur J Pharmacol.2009; 604 (1-3):125-131.

[40] Avramoglu RK,Basciano H,Adeli K.Lipid and lipoprotein dysregulation in insulin resistant states. Clin Chim Acta.2006; 368(1-2):1-19.

引言

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是除酒精和其他明确损肝因素外的一种以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，其与肥胖和胰岛素抵抗密切相关。据不全统计，NAFLD在北美一些国家的患病率为20%-30%，是影响公众健康的主要慢性肝脏疾病之一^[1-2]，在中国已成为仅次于慢性病毒性肝炎的第二大肝病^[3-4]，因此非酒精性脂肪性肝病是一个重大全球性公共健康问题。NAFLD的病理类型包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关肝硬化和肝细胞癌^[5]。尽管非酒精性单纯性脂肪肝的预后一般良好，但有些患者可发展为非酒精性脂肪性肝炎，并可进展为肝硬化和肝功能衰竭^[5]。目前关于NAFLD的发病机制尚未完全阐明。

脂肪组织既是能量储存库，同时也是活跃的内分泌器官，其分泌的脂肪细胞因子可从不同层面影响胰岛素效应^[6]。2005 年，Yang等^[7]利用基因芯片鉴定出一种新的脂肪因子视黄醇结合蛋白4(retinol-binding protein4，RBP4)，其在体内负责结合、转运血浆中的维生素A，是视黄醇类结合蛋白家族中的一员，相对分子质量为21 000-25 000，主要由肝细胞合成，其次为脂肪组织合成；研究提示肥胖小鼠脂肪组织中RBP4升高，引起肌肉组织胰岛素抵抗和肝组织磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶表达升高，最终导致机体胰岛素抵抗，从而证实RBP4与肥胖、胰岛素抵抗密切相关。而肥胖、胰岛素抵抗又是NAFLD发生发展的独立危险因素，因此，RBP4与NAFLD的关系正逐渐受到人们的关注。

目前关于血清RBP4在NAFLD中的表达水平仍存在争议。有研究发现，血清RBP4分泌增加与肝脂肪变和肝损害相关，其可能是NAFLD的独立相关因素^[8-10]。但Cengiz等^[11]研究发现RBP4与NAFLD无相关性，也有多项研究发现NAFLD患者血清RBP4水平降低^[12-14]。另外，人们对RBP4在肝脏中的表达及它与肝脏病理变化的关系知之甚少，因此，RBP4与NAFLD之间的关系有待进一步研究。

NAFLD的治疗包括生活方式的改变和药物治疗等。由于NAFLD 发生发展的确切机制还未完全阐明，关于NAFLD 的防治措施还较局限。目前生活方式的改变在NAFLD的治疗中证明是有效的，其中饮食干预是防治NAFLD的有效方法之一，但是大多数患者并不能坚持实施，这就迫切需要某种有效药物的出现^[15]。二甲双胍通过参与糖脂代谢可增强胰岛素敏感性，而NAFLD与胰岛素抵抗密切相关，因此，许多研究评估了二甲双胍对NAFLD的实验性治疗，发现二甲双胍对NAFLD有一定的疗效^[16-17]，但缺乏双盲对照试验的充分数据来支持。

本实验以高脂饮食建立NAFLD大鼠模型，并予饮食或二甲双胍干预，动态分析各实验组大鼠血清RBP4、肝脏RBP4蛋白和mRNA的表达水平及肝脏病理变化情况，研究RBP4与肝脏病理变化之间的关系，以及饮食干预、二甲双胍治疗对NAFLD的作用，探讨该作用是否是通过影响RBP4的表达获得，为研究NAFLD的发病机制和防治方法提供一定的理论依据。

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材料方法

设计：随机对照动物实验。

时间及地点：实验于2012年2月至2013年6月在厦门大学附属中山医院中心实验室完成。

材料：SPF/VAF级远交系雄性SD大鼠50只，6周龄，体质量190-210 g，购自中科院上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK(沪)2007-0005，由厦门大学医学院动物实验中心提供。

实验方法：

动物模型的制备：将SD大鼠经适应性喂养1周后，随机分为正常对照组16只和高脂饮食组34只，分别给予普通饲料和高脂高能量饲料(含10%猪油、20%蔗糖、2%胆固醇、0.3%胆酸盐、67.7%常规饲料)喂养，实验动物自由进食和饮水。大鼠分笼饲养，每笼4-6只，温度18-22 ℃，相对湿度30%-70%，12 h光照、12 h黑暗。喂养8周后，禁食10 h，从两组各随机取8只大鼠(分别命为8周对照组、8周高脂组)处死，检测相关指标及留取标本。证明NAFLD大鼠模型造模成功后，将高脂饮食组26只大鼠分成16周高脂组(8只，继续进食高脂饲料)、饮食干预组(8只，进食普通饲料)和二甲双胍治疗组(10只，进食高脂饲料及二甲双胍200 mg/(kg•d)灌胃)；正常对照组剩余8只大鼠为16周对照组，继续给予普通饲料喂养，8周后以相同方式处死所有大鼠。造模过程中每周观测实验大鼠精神状态、体型及体质量。肝指数(%) = 肝湿质量(g)×100/体质量(g)。

标本采集：各组大鼠处死前禁食10 h，以乙醚吸入麻醉大鼠，测量身长和体质量后，开胸、腹心脏穿刺取血，血糖仪测量血糖后，将大鼠全血置于不含抗凝剂的离心管中，取血完毕后迅速摘取肝脏，冰生理盐水冲洗，置于无菌纱布上吸干组织周边水分后称肝湿质量，同时观察肝脏的颜色、质地，切取肝右叶相同部位部分肝脏，置于体积分数10%中性甲醛液中固定，剩余肝组织液氮固定后置于-80 ℃冰箱冻存备用。血液标本4 ℃静置2 h后，在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，离心完成后取血清，将血清置于-80 ℃冰箱保存备用。

血清生化指标检测：用酶标仪检测血清三酰甘油、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、谷草转氨酶、谷丙转氨酶浓度，用酶联免疫吸附法测定空腹胰岛素浓度及血清RBP4浓度，严格按说明书进行操作。

肝脏组织形态学观察：标本经乙醇梯度脱水，二甲苯透明、浸蜡后常规包埋；蜡块固定于切片机上作厚4 μm的组织切片，烤片、脱蜡、水化后行苏木精染色9 min，饱和碳酸锂溶液蓝化后行伊红染色15 s，再经乙醇脱水、透明后树脂封固。切片置于光镜下，对于肝组织进行形态学观察。苏木精-伊红染色结果判断以2010年中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组颁布的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》为标准。举荐NAFLD的病理学诊断和临床疗效评估参照美国国立卫生研究院NASH临床研究网病理工作组指南，常规进行NAFLD勾当度积分和肝纤维化分期。

NAFLD勾当度积分0-8分：①肝细胞脂肪变：5%为0分，5%-33%为1分，34%-66%为2分，66%为3分。②小叶内炎症(200倍镜计数坏死灶)：无为0分，2个为1分，2-4个为2分，4个为3分。③肝细胞气球样变：无为0分，少见为1分，多见为2分。NAFLD勾当度积分为半定量评分系统而非诊断法式，小于3分可排除非酒精性脂肪肝肝炎，大于4分则可诊断非酒精性脂肪肝肝炎，介于两者之间者为非酒精性脂肪肝肝炎可能。划定不伴有小叶内炎症、气球样变和纤维化但肝脂肪变33%者为非酒精性单纯脂肪肝，脂肪变达不到此水平者称之为肝细胞脂肪变^[5]。

免疫组织化学检测肝脏RBP4蛋白表达：4 μm的肝脏组织切片在70 ℃烤箱过夜，经二甲苯脱蜡及梯度乙醇水化后，至于1×柠檬酸抗原修复液，140 ℃恒温烤箱中抗原修复20 min，体积分数3%H₂O₂阻断内源性过氧化物酶活性20 min，室温下体积分数10%山羊血清封闭20 min，加入一抗(兔抗鼠 RBP4单克隆抗体，1∶500)37 ℃孵育2 h，PBS冲洗，辣根过氧化物酶链山羊抗兔IgG二抗37 ℃孵育20 min，PBS冲洗，DAB显色，苏木精复染，乙醇梯度脱水，中性树脂封固。用PBS代替一抗作为阴性对照。

Western blotting检测肝脏RBP4蛋白表达：取-80 ℃冻存的大鼠肝组织100 mg，加入1 mL预冷裂解液，冰浴 20 min，剪碎组织，冰上匀浆，将组织研磨成浆，4 ℃ 12 000×g离心15 min，取上清，以BCA法测定提取蛋白浓度。30 μL蛋白质经12% SDS-PAGE垂直凝胶电泳后，电转移至0.22 μm PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，加入1∶1 000稀释的兔抗鼠RBP4单克隆抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后，加入1∶10 000辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，室温作用1 h，TBST洗膜后，滴加ECL发光试剂，显影、摄片。

荧光定量PCR检测肝脏RBP4 mRNA表达：从PubMed中检索出大鼠RBP4、β-Actin的cDNA序列，采用Primer 5.0软件设计引物。引物序列及扩增片断长度如下，引物均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。取冻存的大鼠肝脏组织，用Trizol Reagent试剂盒抽提总RNA，总RNA定性定量检测后用反转录试剂盒进行反转录反应。PCR反应体系(20 μL)：Dream Taq^TM Green PCR Master Mix(2×)10 μL、上游引物 0.5 μL、下游引物 0.5 μL、模板cDNA 0.5 μL、ddH₂O 8.5 μL。将上述反应混合液加入PCR管中，混匀后，置于低速离心机上离心，确保无气泡，管壁无残留液体，将PCR管插入PCR仪的反应板中进行扩增反应。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，28个循环，最后72 ℃再5 min。扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳，取扩增产物8 μL，120 V恒压电泳25-30 min，紫外成像系统下观察记录电泳条带，用凝胶成像分析系统采集图像。以RBP4/β-Actin总灰度比值表示RBP4 mRNA相对表达量。

主要观察指标：大鼠肝脏组织RBP4蛋白及mRNA表达。

统计学分析：计量资料用x(_)±s表示，采用SPSS 16.0进行统计学处理，如果数据服从正态分布且方差齐性，两样本均数比较采用t 检验；如果数据不服从正态分布或者方差不齐，采用秩和检验，检验水准α= 0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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讨论

饮食结构和遗传因素是引起和促进NAFLD发生和发展的两个最重要的因素^[18]。本实验通过高脂饮食建立NAFLD大鼠模型，模拟NAFLD的发生发展过程，其结果接近临床上成人NAFLD的病理生理改变。结果表明8周高脂组表现出单纯的肝脏脂肪变性，伴随着高脂饮食喂养时间的延长，16周高脂组肝脏出现明显的脂肪变性、气球样变及炎症浸润反应，同时出现脂代谢紊乱、胰岛素抵抗及肝功能损害等变化，说明高脂饮食喂养可成功建立NAFLD大鼠模型，这与大多数研究的造模结果一致^[10^，^19-20]。非酒精性脂肪性肝炎的病理改变介于单纯性脂肪肝和肝硬化之间，主要以肝细胞损伤为特征^[21-22]，可能进展为肝纤维化、肝硬化和肝癌，甚至肝衰竭。根据中华医学会肝病学分会脂肪肝和酒精性肝病学组颁布的《非酒精性脂肪性肝病诊疗指南》为参考^[5]，本实验中16周高脂组大鼠可诊断为非酒精性脂肪性肝炎，说明本实验利用高脂饮食喂养成功构建了NAFLD大鼠模型，并且模拟了NAFLD从单纯性脂肪肝到非酒精性脂肪性肝炎的疾病自然发展进程。

近几年的研究发现RBP4不仅是结合、转运血浆维生素A的运载蛋白^[23]，而且也是参与胰岛素抵抗和NAFLD发生发展的一种脂肪因子^[24-25]，其主要由肝细胞合成，其次为脂肪组织合成^[26]，且肝脏中存在特定的RBP4细胞表面受体^[27]，RBP4可能在NAFLD的发生发展中发挥一定作用。

目前关于血清RBP4在NAFLD中的表达水平存在较大争议。Yang等^[7]研究发现血清RBP4在胰岛素抵抗小鼠及肥胖和2型糖尿病患者中升高，并认为RBP4在胰岛素抵抗发病机制中的作用是增加肝脏PEPCK的表达，损害肌肉胰岛素信号通路。另有一些研究也证实血清RBP4在NAFLD中升高，且与胰岛素抵抗呈正相关^[8-10^，^28]，同时有研究表明，血清RBP4分泌增加与肝脂肪变和肝损害相关，其可能是NAFLD的独立相关因素^[8-10]，提示RBP4可能在NAFLD的发病机制中起一定的作用。但另一些研究结果则不同，Cengiz等^[11]研究发现血清RBP4与NAFLD无相关性，或血清RBP4水平在NAFLD患者中表达降低^[12-14]，血清RBP4与胰岛素抵抗无相关性^[12-14^，^29]。本实验通过检测高脂饮食喂养大鼠在NAFLD发病不同阶段血清RBP4的水平，结果表明各组大鼠血清RBP4水平无统计学差异。Brandauer等^[30]实验结果也发现高脂饮食对血清RBP4无明显影响。

但是，人们对RBP4在NAFLD发病过程中肝组织的表达情况，以及它与肝组织病理变化之间的关系知之甚少。本实验中肝脏病理学检查发现，8周高脂组大鼠肝组织脂肪变明显，为交界性非酒精性脂肪性肝炎；16周高脂组大鼠肝组织脂肪变更严重，肝细胞排列紊乱，可见成群炎性细胞浸润，为明确的非酒精性脂肪性肝炎病理改变。非酒精性脂肪性肝炎是单纯脂肪变和肝硬化之间的关键过渡阶段，主要以肝细胞损伤为特征^[22]。本实验中Spearman相关分析结果表明，肝组织RBP4的免疫组织化学评分与肝脏炎症程度呈负相关，提示肝组织RBP4表达下降可能与肝细胞损伤有关。本实验还发现，饮食干预能明显改善肝组织脂肪变，并且恢复肝组织RBP4蛋白和mRNA的表达水平；而二甲双胍治疗无改善肝组织RBP4表达的作用。在NAFLD发生过程中肝脏RBP4表达下降，饮食干预增加了肝组织RBP4表达，改善了非酒精性脂肪性肝炎的组织学病理变化，提示RBP4可能在NAFLD发病中起一定作用，具体作用机制有待进一步研究。

血清RBP4主要由肝脏和脂肪组织合成。推测本实验中高脂喂养NAFLD大鼠血清RBP4水平未随着肝组织RBP4的表达降低而降低，可能是由于高脂饮食使大鼠脂肪组织增多，导致脂肪组织中RBP4表达升高，从而代偿了肝组织合成减少的RBP4量。遗憾的是本实验未检测脂肪组织RBP4的表达。由于血清RBP4水平受多种因素(脂肪组织、肝脏功能等)的影响，所以血清RBP4在NAFLD的发生、发展中可能不是一个敏感指标，这与Lewis等^[31]的研究结果一致。

众所周知，目前针对NAFLD的特异性药物治疗尚未达成共识，生活方式干预(饮食、运动)仍是治疗NAFLD的基础。二甲双胍可以改善外周胰岛素的敏感性，于20世纪50年代被应用于临床，现作为治疗2型糖尿病的一线药物^[32]，尤其适合伴有腹型肥胖的患者，其安全性和耐受性良好^[33]。肥胖和胰岛素抵抗是NAFLD发生发展的主要因素，而二甲双胍具有减轻体质量和增加胰岛素敏感性的作用，因此可作为NAFLD的治疗药物^[34]。但二甲双胍治疗NAFLD的疗效和作用机制尚不完全清楚。研究发现二甲双胍治疗联合饮食干预能有效治疗NAFLD^[17^，^35-38]，单独二甲双胍治疗NAFLD亦有效^[39]。本实验探讨了饮食干预或二甲双胍治疗NAFLD的疗效，并比较饮食干预或二甲双胍治疗对RBP4表达的影响。与正常对照组相比，高脂饮食组大鼠血清三酰甘油、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，谷草转氨酶和谷丙转氨酶，胰岛素和胰岛素抵抗指数均显著升高，这与之前的研究报道一致^[13^，^40]，即NAFLD常伴有肝酶升高、血脂异常和胰岛素抵抗。本实验结果表明单独二甲双胍治疗没有明显减轻大鼠体质量，但减轻了大鼠肝脏组织脂肪变。饮食干预组大鼠与高脂饮食喂养16周大鼠相比体质量降低了约6%，脂质代谢得到改善，肝脏组织病理学变化明显改善，包括肝组织脂肪变性、气球样变及炎症反应。饮食干预组大鼠肝组织病理变化较二甲双胍治疗组改善明显。饮食干预可明显改善血脂参数，而单用二甲双胍治疗对血脂参数几乎没有改善作用，结合1998年Day和James提出的关于非酒精性脂肪性肝炎的“二次打击”学说(认为脂质在肝脏中沉积是第一次打击)，与单用二甲双胍治疗相比，饮食干预可能减少了脂质在肝脏中沉积(减少了NAFLD的第一次打击)，从而减轻NAFLD的病理病变，这在一定程度上解释了本实验饮食干预较单用二甲双胍治疗有效的原因。饮食干预、二甲双胍治疗均明显降低血清谷草转氨酶水平并具有改善胰岛素抵抗的趋势，同时，饮食干预也有降低血清谷丙转氨酶的趋势，但二甲双胍治疗却升高血清谷丙转氨酶水平。血清谷丙转氨酶升高提示NAFLD病情进展及肝脏炎症病变^[35]，本实验中二甲双胍治疗组的肝脏病理分级为非酒精性脂肪性肝炎，证实二甲双胍治疗组大鼠肝功能受损，提示二甲双胍治疗不足以阻止高脂饮食引起的NAFLD进展。尤其是，二甲双胍治疗组血清谷丙转氨酶水平较16周高脂组高，表明二甲双胍对非酒精性脂肪性肝炎有加重肝损害的作用，亦有二甲双胍致肝损害的临床病例报道。其中乳酸酸中毒是二甲双胍最严重的不良反应，该不良反应可使肝功能不全进一步加重。推测在NAFLD疾病的早期，二甲双胍治疗可能有效，但在严重期(非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化)二甲双胍可能无法改善该疾病的预后。有研究用二甲双胍治疗肝炎、肝硬化等严重的NAFLD，发现治疗组与对照组相比无统计学差异，证实二甲双胍不能改善严重NAFLD的预后。因此，将来的研究需进一步明确应用二甲双胍治疗NAFLD的时机。

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众所周知，目前针对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）的特异性药物治疗尚未达成共识，生活方式干预（饮食、运动）仍是治疗NAFLD的基础。二甲双胍可以改善外周胰岛素的敏感性，于20世纪50年代被应用于临床，现作为治疗2型糖尿病的一线药物，尤其适合伴有腹型肥胖的患者，其安全性和耐受性良好。肥胖和胰岛素抵抗是NAFLD发生发展的主要因素，而二甲双胍具有减轻体质量和增加胰岛素敏感性的作用，因此可作为NAFLD的治疗药物。但二甲双胍治疗NAFLD的疗效和作用机制尚不完全清楚。研究发现二甲双胍治疗联合饮食干预能有效治疗NAFLD，单独二甲双胍治疗NAFLD亦有效。本实验探讨了饮食干预或二甲双胍治疗NAFLD的疗效，并比较饮食干预或二甲双胍治疗对RBP4表达的影响。与正常对照组相比，高脂饮食组大鼠血清三酰甘油、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇，谷草转氨酶和谷丙转氨酶，胰岛素和胰岛素抵抗指数均显著升高，这与之前的研究报道一致，即NAFLD常伴有肝酶升高、血脂异常和胰岛素抵抗。本实验结果表明单独二甲双胍治疗没有明显减轻大鼠体质量，但减轻了大鼠肝脏组织脂肪变。饮食干预组大鼠与高脂饮食喂养16周大鼠相比体质量降低了约6%，脂质代谢得到改善，肝脏组织病理学变化明显改善，包括肝组织脂肪变性、气球样变及炎症反应。饮食干预组大鼠肝组织病理变化较二甲双胍治疗组改善明显。饮食干预可明显改善血脂参数，而单用二甲双胍治疗对血脂参数几乎没有改善作用，结合1998年Day和James提出的关于非酒精性脂肪性肝炎的“二次打击”学说^[^{41^]（认为脂质在肝脏中沉积是第一次打击}），与单用二甲双胍治疗相比，饮食干预可能减少了脂质在肝脏中沉积（减少了NAFLD的第一次打击），从而减轻NAFLD的病理病变，这在一定程度上解释了本实验饮食干预较单用二甲双胍治疗有效的原因。饮食干预、二甲双胍治疗均明显降低血清谷草转氨酶水平并具有改善胰岛素抵抗的趋势，同时，饮食干预也有降低血清谷丙转氨酶的趋势，但二甲双胍治疗却升高血清谷丙转氨酶水平。血清谷丙转氨酶升高提示NAFLD病情进展及肝脏炎症病变，本实验中二甲双胍治疗组的肝脏病理分级为非酒精性脂肪性肝炎，证实二甲双胍治疗组大鼠肝功能受损，提示二甲双胍治疗不足以阻止高脂饮食引起的NAFLD进展。尤其是，二甲双胍治疗组血清谷丙转氨酶水平较16周高脂组高，表明二甲双胍对非酒精性脂肪性肝炎有加重肝损害的作用，亦有二甲双胍致肝损害的临床病例报道。其中乳酸酸中毒是二甲双胍最严重的不良反应，该不良反应可使肝功能不全进一步加重。推测在NAFLD疾病的早期，二甲双胍治疗可能有效，但在严重期（非酒精性脂肪性肝炎和肝纤维化）二甲双胍可能无法改善该疾病的预后。Uygun等用二甲双胍治疗肝炎、肝硬化等严重的NAFLD，发现治疗组与对照组相比无统计学差异，证实二甲双胍不能改善严重NAFLD的预后。因此，将来的研究需进一步明确应用二甲双胍治疗NAFLD的时机。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：肾移植；肝移植；移植；心脏移植；组织移植；皮肤移植；皮瓣移植；血管移植；器官移植；组织工程

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非酒精性脂肪性肝病模型大鼠饮食或二甲双胍干预后肝视黄醇结合蛋白4表达

Effects of dietary intervention versus metformin treatment on retinol binding protein 4 expressions in rats with non-alcoholic fatty liver disease

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[1]	张同同, 王中华, 文杰, 宋玉鑫, 刘林. 3D打印模型在颈椎肿瘤手术切除与重建中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(9): 1335-1339.
[2]	曾燕华, 郝延磊. 许旺细胞体外培养及纯化的系统性综述[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1135-1141.
[3]	徐东紫, 张婷, 欧阳昭连. 心脏组织工程领域全球专利竞争态势分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 807-812.
[4]	吴子健, 胡昭端, 谢有琼, 王峰, 李佳, 李柏村, 蔡国伟, 彭锐. 3D打印技术与骨组织工程研究文献计量及研究热点可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 564-569.
[5]	常文辽, 赵杰, 孙晓亮, 王锟, 吴国锋, 周剑, 李树祥, 孙晗. 人工骨膜的材料选择、理论设计及生物仿生功能[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 600-606.
[6]	刘旒, 周箐竹, 龚桌, 刘博言, 杨斌, 赵娴. 胶原/无机材料构建组织工程骨的特点及制造技术[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 607-613.
[7]	刘飞, 崔宇韬, 刘贺. 局部抗生素递送系统治疗骨髓炎的优势与问题[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 614-620.
[8]	李晓壮, 段浩, 王伟舟, 唐志宏, 王旸昊, 何飞. 骨组织工程材料治疗骨缺损疾病在体内实验中的应用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 626-631.
[9]	张振坤, 李喆, 李亚, 王莹莹, 王亚苹, 周馨魁, 马珊珊, 关方霞. 海藻酸盐基水凝胶/敷料在创面愈合中的应用：持续、动态与顺序释放[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 638-643.
[10]	陈佳娜, 邱燕玲, 聂敏海, 刘旭倩. 组织工程支架材料修复口腔颌面部软组织缺损[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 644-650.
[11]	邢浩, 张永红, 王栋. 长骨大段骨缺损修复方法的优势与不足[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(3): 426-430.
[12]	陈思奇, 先德彬, 徐荣胜, 覃中杰, 张磊, 夏德林. 羟基磷灰石-磷酸三钙支架复合骨髓间充质干细胞和人脐静脉内皮细胞对大鼠颅骨缺损修复早期成血管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3458-3465.
[13]	刘鋆, 杨龙, 王伟宇, 周玉虎, 吴颖, 卢涛, 舒莉萍, 马敏先, 叶川. 聚3-羟基丁酸酯4-羟基丁酸酯/聚乙二醇/氧化石墨烯组织工程支架的制备和性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3466-3472.
[14]	王皓, 陈明学, 李俊康, 罗旭江, 彭礼庆, 李获, 黄波, 田广招, 刘舒云, 眭翔, 黄靖香, 郭全义, 鲁晓波. 脱细胞猪皮基质构建组织工程半月板支架[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3473-3478.
[15]	莫剑玲, 何少茹, 冯博文, 简敏桥, 张晓晖, 刘财盛, 梁一晶, 刘玉梅, 陈亮, 周海榆, 刘艳辉. 构建预血管化细胞膜片及血管形成相关因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3479-3486.